|
|
Targeted editing of the Arabidopsis CYP98A3 gene using the CRISPR/Cas9 method
Šamaj, Matej
Lignin je biopolymer, který plní několik důležitých funkcí včetně usnadnění polárního transportu vody a mechanického zpevnění rostlinného těla. Je nezbytný pro správný růst a vývoj rostlin, ale také pro obranné reakce rostlin. Komplexní biosyntéza ligninu zahrnuje aktivitu mnoha enzymů katalyzujících navazující chemické reakce, které postupně vytvářejí různé prekurzory pro syntézu ligninu. Jeden takový enzym biosyntetické dráhy ligninu, P‐KUMAROYL ŠIKIMÁT 3′‐HYDROXYLÁZA (C3′H), je kódován genem CYP98A3/C3′H a přeměňuje p-kumaroyl šikimát na kafeoyl šikimát. Systémy CRISPR/Cas adaptované z bakterií, kde poskytují adaptivní imunitu, se velmi rychle vyvinuly v jedinečný a výkonný nástroj pro přesnou editaci genů. Technologie CRISPR/Cas9 umožňuje specificky zacílit na požadovaná místa v genomech a následně provést velmi přesnou mutagenezi vybraného genu (genů). Cílem této práce bylo pomocí metody CRISPR/Cas9 provést cílenou editaci genu CYP98A3/C3′H v transformovaných rostlinách Arabidopsis thaliana. Vybrané transformované rostliny byly ověřeny, aby se potvrdila přítomnost úpravy genu zprostředkované CRISPR/Cas9. Ověřená předpokládaná mutantní rostlina T2 generace vykazovala změněné fenotypy listů, listových růžic, stonků a květenství doprovázené nižším ukládáním ligninu, jak bylo zjištěno histochemickým barvením bazickým fuchsinem a mikroskopickými pozorováními.
|
|
|
triggers of asexual reproduction: on the crosslink between hybridization, asexuality, polyploidy and speciation on example of Cobitidae loaches
Marta, Anatolie ; Janko, Karel (vedoucí práce) ; Arai, Katsutoshi (oponent) ; Trachtulec, Zdeněk (oponent)
Sexuální reprodukce je u eukaryotických organismů považována za téměř univerzální způsob rozmnožování a má se za to, že jde o evolučně původní stav. Sexuální reprodukce je reprezentována meiotickým dělením, rekombinací, produkcí haploidních gamet a fertilizací. Ačkoliv jsou základní molekulární a cytologické mechanismy meiotického dělení vysoce konzervativní, mohou být narušeny mnoha způsoby, které vedou k výskytu takzvaných asexuálních linií. Původ asexuality se může u jednotlivých taxonů lišit. U obratlovců se spouštěcím mechanismem jeví mezidruhová hybridizace. Současné "klasické" teorie předpokládají, že by asexualita v dlouhodobém evolučním horizontu neměla přetrvat. I přes to jsou mnohé hybridní linie schopny překonat post-zygotické bariéry, způsobující problémy jako kompletní hybridní sterilitu, pozměněnou meiózu vedoucí k asexuálnímu rozmnožování, nebo také zvýšení ploidní úrovně. Přestože jedním z nejčastějších důsledků mezidruhového křížení je sterilita hybridů, mnohé taxony našly způsob, jak produkovat funkční klonální gamety. Znalosti přesných mechanismů formování neredukovaných gamet u asexuálních linií jsou však značně limitovány metodologickými a technologickými obtížemi. Sekavci rodu Cobitis jsou jedním z nejvhodnějších modelů ke studiu otázek týkajících se hybridizace, původu...
|
|
|
CRISPR/Cas9 gene editing in Drosophila melanogaster
KALTENBÖCK, Konstantin
The aim of this thesis was to predict functional sites in the timeless gene of Drosophila melanogaster, to design fitting gRNAs for the identified sites to create transformation vectors for fly transformations and to induce CRISPR/Cas9 mediated target mutations by crossing gRNA expressing flies with Cas9 expressing flies.
|
|
|
Nanoparticles for gene editing
Kružíková, Zuzana ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
Časné genové terapie založené na DNA byly testovány pro terapeutické účely, dříve či později se ovšem objevila řada překážek a rizik spojených s jejich využíváním, což zastavilo další klinické testování. Poměrně nedávno byly tyto metody nahrazeny rychle se rozvíjejícím genovým editováním za pomoci programovaných nukleas, které jsou schopny štěpit specifické sekvence DNA a tak vytvořit přesné genomové modifikace. Jako potenciální terapeutika jsou testovány nukleasy s motivem zinkového prstu (ZFN), dále tzv. "transcription activator-like effector" nukleasy (TALEN) či CRISPR/Cas9 systémy. Největším rizikem, kterému je nutné zabránit, jsou chybná štěpení mimo cílové sekvence. Jako nejvhodnější metoda pro aplikaci do buněk se jeví cílené dopravování nukleas ve formě mRNA. Nanočástice různých typů umožňují přenos mRNA a usnadňují tak dopravování nukleas do buněk. Tato bakalářská práce popisuje některé z těchto nanočástic společně s charakterizací programovaných nukleas.
|
|
|
Porcine models for Huntington disease
Růna Vochozková, Petra ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Bohačiaková, Dáša (oponent) ; Fulková, Helena (oponent)
Kauzální gen huntingtin (HTT) Huntingtonovy choroby byl identifikován před více než 25 lety. Prodloužení CAG opakovaného úseku na více než 39 opakování v exonu 1 jedné HTT alely je dostatečné pro úplnou penetraci této neurodegenerativní choroby. I když identifikace ňkauzální mutace vytvořila naději, že vývoj terapeutických léčiv bude snadno dosažitelný, pacienti a jejich rodiny dosud čekají na léčbu. Hlavním důvodem může být komplexní funkce proteinu HTT v buňce, která stěžuje stanovení konkrétního patologického mechanismu, což se odráží na vývoji léčiv. Přestože bylo dosud vytvořeno mnoho různých zvířecích modelů, žádný z nich plně nekopíruje onemocnění u pacientů. Miniprase se díky své anatomii, fyziologii a genetice zdá být vhodným kandidátem na modely neurodegenerativních nemocí. Ačkoliv transgenní (Tg) miniprasečí Liběchovský model projevuje některé příznaky typické pro HD u pacientů, jako poruchy mužského reprodukčního systému a zvýšené markery neurodegenerace, jsou také pozorovány zjevné nesrovnalosti.Důvodem může být skutečnost, že genetická modifikace je založena na aditivním transgenu kódujícím mutovaný a zkrácený konstrukt cDNA a tudíž neodrážíi četné regulační procesy, od iniciace transkripce až po post- translační modifikace kódovaného proteinu. Lepším odrazem lidské situace jsou...
|
|
|
Porcine models for Huntington disease
Růna Vochozková, Petra ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Bohačiaková, Dáša (oponent) ; Fulková, Helena (oponent)
Kauzální gen huntingtin (HTT) Huntingtonovy choroby byl identifikován před více než 25 lety. Prodloužení CAG opakovaného úseku na více než 39 opakování v exonu 1 jedné HTT alely je dostatečné pro úplnou penetraci této neurodegenerativní choroby. I když identifikace ňkauzální mutace vytvořila naději, že vývoj terapeutických léčiv bude snadno dosažitelný, pacienti a jejich rodiny dosud čekají na léčbu. Hlavním důvodem může být komplexní funkce proteinu HTT v buňce, která stěžuje stanovení konkrétního patologického mechanismu, což se odráží na vývoji léčiv. Přestože bylo dosud vytvořeno mnoho různých zvířecích modelů, žádný z nich plně nekopíruje onemocnění u pacientů. Miniprase se díky své anatomii, fyziologii a genetice zdá být vhodným kandidátem na modely neurodegenerativních nemocí. Ačkoliv transgenní (Tg) miniprasečí Liběchovský model projevuje některé příznaky typické pro HD u pacientů, jako poruchy mužského reprodukčního systému a zvýšené markery neurodegenerace, jsou také pozorovány zjevné nesrovnalosti.Důvodem může být skutečnost, že genetická modifikace je založena na aditivním transgenu kódujícím mutovaný a zkrácený konstrukt cDNA a tudíž neodrážíi četné regulační procesy, od iniciace transkripce až po post- translační modifikace kódovaného proteinu. Lepším odrazem lidské situace jsou...
|
|
|
Nanoparticles for gene editing
Kružíková, Zuzana ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
Časné genové terapie založené na DNA byly testovány pro terapeutické účely, dříve či později se ovšem objevila řada překážek a rizik spojených s jejich využíváním, což zastavilo další klinické testování. Poměrně nedávno byly tyto metody nahrazeny rychle se rozvíjejícím genovým editováním za pomoci programovaných nukleas, které jsou schopny štěpit specifické sekvence DNA a tak vytvořit přesné genomové modifikace. Jako potenciální terapeutika jsou testovány nukleasy s motivem zinkového prstu (ZFN), dále tzv. "transcription activator-like effector" nukleasy (TALEN) či CRISPR/Cas9 systémy. Největším rizikem, kterému je nutné zabránit, jsou chybná štěpení mimo cílové sekvence. Jako nejvhodnější metoda pro aplikaci do buněk se jeví cílené dopravování nukleas ve formě mRNA. Nanočástice různých typů umožňují přenos mRNA a usnadňují tak dopravování nukleas do buněk. Tato bakalářská práce popisuje některé z těchto nanočástic společně s charakterizací programovaných nukleas.
|
|
|
TAL Effectors: Tools for DNA Targeting
Jankele, Radek ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Přes dvacet let trvající výzkum interakcí fytopatogenních bakterií rodu Xanthomonas s jejich hostiteli vyústil objevem nové proteinové rodiny nazvané Transcription Activator like (TAL) efektory. TAL efektory jsou hlavní faktory virulence umožňující rozmnožování a následné šíření bakterií změnami genové exprese rostlinných buněk. TAL efektory rozpoznávají prostřednictvím struktury jejich DNA-vazebné domény specifické sekvence v promotorech hostitelských genů, jejichž transkripci následně aktivují. DNA-vazebná doména obsahuje krátké repetitivní peptidové moduly, které obtáčejí dvouvláknovou DNA a vytvářejí tak unikátní strukturní motiv. Jednotlivé moduly rozpoznávají po sobě jdoucí nukleotidy v cílové sekvenci prostřednictvím jedné ze dvou polymorfních aminokyselin ve smyčce kontaktující velký žlábek DNA. Dvojce těchto aminokyselin určují rozpoznávané nukleotidy takto: NI > A, HD > C, NH > G, NG > T a NN > A nebo G. Tento jednoduchý kód umožňuje přípravu umělých TAL DNA-vazebných domén s požadovanou sekvenční specifitou během jednoho týdne s minimálními náklady. Umělé TAL domény spojené s nukleázovou nebo aktivační doménou nacházejí uplatnění ve výzkumu, biotechnologii a genové terapii pro cílené genové modifikace a pro regulaci genové exprese. TAL efektor nukleázy (TALENy) umožňují provádět cílené genové...
|
host ::
RSS.